Informasi dan Tips – informasitips.com

Metode DPPH: Uji Antioksidan

informasitips.com – Pengukuran aktivitas antioksidan menggunakan Metode DPPH atau Diphenylpicrylhydrazyl pertama kali dilaporkan oleh Blois pada tahun 1958. Referensi: Blois MS (1958) Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature 26: 1199-1200.

Prinsip Metode DPPH

Pengukuran antioksidan dengan metode DPPH pada prinsipnya adalah mengukur terjadinya pemudaran warna dari radikal DPPH akibat adanya antioksidan yang dapat menetralkan molekul radikal bebas. Jadi, radikal DPPH yang sebelumnya berwarna akan kehilangan warnanya jika ada antioksidan, karena antioksidan akan menyumbangkan elektronnya kepada radikal DPPH, sehingga radikal yang sebelumnya tidak stabil (akibat adanya elektron yang tidak berpasangan) menjadi stabil (electron di radikal bebas kini menjadi berpasangan karena mendapat sumbangan electron dari antioksidan). Pada dasarnya, karakteristik antioksidan adalah mudah untuk menyumbangkan elektron, semakin mudah memberikan elektron maka sifat antioksidannya semakin kuat.

Perubahan Warna pada Metode DPPH

Metode DPPH Antioksidan

Radikal DPPH merupakan chromogen (memiliki warna) yang dapat menyerap kuat sinar pada panjang gelombang antara 515 dan 528 nm. Saat radikal DPPH bertemu dengan senyawa yang mudah untuk menyumbangkan elektron, seperti antioksidan, maka akan bereaksi dan berubah menjadi senyawa diphenylpicrylhydrazine yang berwarna kuning pucat. Di saat yang sama, absorbansinya pada panjang gelombang antara 515 dan 528 nm juga akan berkurang akibat hilangnya sinyal resonansi paramagnetic dari electron atau Electron Paramagnetic Resonance (EPR) radikal bebas. Pengurangan absorbansi itu linear dengan pengurangan jumlah radikal bebas yang distabilkan oleh antioksidan, dan pengurangan absorbansi itu diukur dengan menggunakan Spektrofotometer.

Prosedur Metode DPPH

Pembuatan Larutan DPPH: Larutan DPPH dibuat sedemikian rupa sehingga memiliki konsentrasi akhir sebesar 0.12 M. Caranya adalah 23.5 mg DPPH ditimbang dan dimasukkan ke dalam 100 ml labu ukur. 50 mL methanol dimasukkan ke dalam labu ukur, lalu dilarutkan. 100 mL labu ukur dicukupkan volumenya dengan menggunakan methanol. Larutan DPPH tersebut memiliki konsentrasi 0.6 M. Untuk mendapatkan larutan DPPH dengan konsentrasi 0.12 M, maka larutan diencerkan dengan menggunakan methanol (1:5 v/v).

Larutan Stok Trolox dibuat dengan cara 5 mg Trolox ditimbang dan dimasukkan ke dalam tube 2 mL. 1 mL methanol ditambahkan ke dalam tube dan Trolox dilarutkan.

Berikut ini langkah demi langkah dalam melakukan metode DPPH:

  • Pembuatan Kurva Standard. Senyawa standard yang digunakan biasanya adalah asam askorbat atau larutan Trolox. Untuk penggunaan larutan stok Trolox, 50 mikroliter larutan stok Trolox diencerkan ke dalam 950 mikroliter methanol. Dari larutan tersebut (1 mM), sejumlah konsentrasi dipersiapkan dengan cara mengencerkannya dalam methanol. Seri konsentrasi larutan Trolox tersebut terdiri dari 0, 24, 28, 32, 36 dan 40 mikroMolar.
  • Larutan sampel dipersiapkan dengan konsentrasi sedemikian rupa sehingga persentase penghambatan DPPH-nya mencapai kisaran 20-80%. Hal tersebut mungkin akan membutuhkan serangkaian trial and error.
  • 100 mikroliter sampel atau larutan Trolox dicampurkan dengan 100 mikroliter larutan DPPH dalam microplate lalu diukur menggunakan microplate reader (spektrofotometer) pada panjang gelombang 515 nm.
  • Jika tidak menggunakan microplate, maka reaksi antara DPPH dengan sampel atau Trolox dapat dilakukan di tabung reaksi dengan masing-masing volume yang berbanding 1 : 1.
  • Campuran larutan sampel/Trolox dengan larutan DPPH disimpan dalam tempat gelap pada suhu ruang selama 30 menit.
  • Setelah 30 menit, larutan diukur menggunakan Spektrofotometer pada panjang gelombang 515 nm.
  • Kapasitas antioksidan sampel dihitung sebagai persentase inhibisi (% I) radikal DPPH pada panjang gelombang 515 nm dengan menggunakan formula berikut ini:

    % I = [(Ao – A1) / Ao] x 100

    Keterangan: Ao = absorbansi DPPH pada larutan kontrol/methanol (blank) setelah 30 menit. A1 = absorbansi larutan sampel/Trolox setelah diinkubasi selama 30 menit.

Ada beberapa catatan terkait Metode DPPH ini, yaitu:

  • DPPH memiliki sifat hidrofobik, yaitu tidak larut dalam air dan hanya bisa larut dalam pelarut organic. Oleh karena itu, metode DPPH terbatas hanya pada antioksidan yang larut dalam pelarut hidrofob, sementara untuk antioksidan berbasis air penggunaannya terbatas, tergantung dari tingkat kelarutan DPPH yang sangat kecil di dalam air. Hal itu bukan berarti DPPH tidak bisa digunakan pada antioksidan yang bersifat hidrofilik. Cara yang bisa dilakukan adalah dengan menggunakan campuran larutan Metanol : Air (1 : 1 v/v). Dengan begitu DPPH bisa digunakan baik untuk antioksidan hidrofob maupun hidrofil.
  • Larutan stok DPPH mudah bereaksi dengan cahaya dan oksigen, sehingga dapat mengalami degradasi. Untuk menghindari atau meminimalisir hal tersebut, maka larutan stok harus ditutup denan aluminium foil dan disimpan di tempat yang gelap. Dengan begitu, larutan stok DPPH dapat bertahan hingga 1 minggu.


loading...
Bagikan artikel:

Artikel Terkait

Tinggalkan Balasan

Alamat surel Anda tidak akan dipublikasikan. Ruas yang wajib ditandai *